Enzimoterapia- miracolul naturii

Termenul de „enzimă” provine din limba greacă (zymosis) unde însemna ferment.  Enzimele reprezintă proteine sau proteide fără de care celulele vii nu pot realiza reacţii complexe intr-un timp scurt,  la temperatura normală a mediului înconjurător.  Ele sunt substanţe care catalizează toate reacţiile biochimice din organism,  având un rol esenţial in biosinteza şi in degradarea substanţelor din materia vie,  şi de aceea enzimele pot fi întâlnite in toate organismele animale,  vegetale,  umane şi in microorganisme,  mai fiind denumite,  din această cauză,  şi biocatalizatori.  De fapt,  ele sunt nişte mici uzine microscopice.  Fără enzime,  procesele biochimice s-ar desfăşura cu viteze foarte mici.

Cum a început totul? Desigur că enzimele există dintotdeauna,  dar descoperirea lor şi punerea lor in valoare are o poveste proprie.  

Încă din anul 1700 şi mai târziu in 1800 s-a observat digestia cărnii de către sucurile gastrice,  conversia amidonului in zahăr sub acţiunea salivei,  dar Louis Pasteur,  pe când studia fermentaţia zahărului in alcool in prezenţa drojdiei de bere ajunge la concluzia că acest proces de fermentaţie se  datorează prezenţei in drojdia de bere a ceea ce se numeşte „ferment”,  care are activitate numai in interiorul organismelor vii.  

Rolul enzimelor in cadrul organismelor:

·                    descompunerea moleculelor mari

·                    accelerarea proceselor metabolice

·                    coordonează unele etape ale ciclului metabolic

 Structura enzimelor

Enzimele sunt substanţe de natură proteică.  Acestea reprezintă macromolecule compuse din lanţuri polipeptidice,  având o masă moleculară intre 10. 000 – 1. 000. 000.

Mecanismul reacţiei

Enzima formează cu substratul un produs intermediar reactiv,  cu viaţă scurtă.  Sub această formă intermediară,  substratul intrat in reacţie suferă modificări electrice sub acţiunea centrilor activi ai enzimei,  rezultând procesul de reacţie.  

Activitatea enzimelor.  Când o reacţie poate fi catalizată atât de o enzimă cât şi de substanţe simple se constantă de obicei că reacţia enzimatică decurge cu viteză mult mai mare; cu alte cuvinte,  reacţia enzimatică are o energie de activare mult mai mică.  Astfel s-a stabil că este necesară o concentraţie de ioni de hidrogen de 10 milioane de ori mai mare decât de invertază pentru a hidroliza o anumită cantitate de zaharoză,  intr-un timp dat,  la 37˚.

            Datorită acestei enorme activităţi catalitice,  sunt suficiente de obicei concentraţii foarte mici de enzimă pentru a obţine efecte considerabile.

            Activitatea enzimelor nu durează indefinit ca acea a catalizatorilor simpli şi este in general mai scurtă decât aceea a catalizatorilor heterogeni.  In cazul reacţiilor enzimatice,  cu cât trece timpul,  cu atât cantitatea de substrat transformată in unitatea de timp se micşorează,  iar după un timp mai lung reacţia practic încetează.  Inactivarea enzimelor se explică prin denaturarea lor sau prin alte transformări datorită caracterului lor de proteine globulare.  Celulele vii sintetizează enzime fără încetare.

Temperatura optimă a reacţiilor enzimatice.  Viteza reacţiilor enzimatice creşte ca a celor mai multe reacţii intre molecule covalente,  cu temperatura,  şi anume o urcare a temperaturii cu 10˚ produce o creştere a vitezei de reacţie cu un coeficient 1. 5 – 3.  Creşterea aceasta se observă insă numai la temperaturi joase.  Odată depăşită o anumită temperatură optimă,  la care viteza este maximă,  aceasta scade,  iar la temperaturi mai înalte,  reacţia încetează.  Fenomenul se explică prin faptul,  semnalat mai sus,  că la temperaturi mai înalte,  enzimele sunt inactivate prin denaturarea componentei proteice.  Cele mai multe enzime devin complet inactive intre 50-80˚.  Temperatura optimă nu poate fi insă exact definită,  căci ea variază in limite largi,  cu concentraţia enzimei,  cu concentraţia ionilor de hidrogen şi cu prezenţa diferitelor impurităţi ale preparatului enzimatic sau ale substratului.

Influenţa pH-ului.  După cum a arătat Sörensen (1909),  activitatea enzimelor depinde,  intr-o foarte mare măsură de concentraţia ionilor de hidrogen din soluţie.  Curbele reprezentând variaţia vitezei de reacţie cu pH-ul prezintă de obicei un maxim pronunţat la un anumit pH,  in timp ce la valori ale pH-ului diferind cu 1 faţă de acest maxim,  viteza de reacţie prezintă valori considerabil mai mici.  Din cauza acestei particularităţi este necesar ca in cursul reacţiilor enzimatice să se menţină pH-ul optim constant,  prin folosirea de tampoane.

Specificitatea enzimelor.  O anumită enzimă catalizeză numai un număr mic de reacţii şi de multe ori o singura reacţie,  spre deosebire de catalizatori obişnuiţi anorganici (acizi,  baze,  catalizatori de hidrogenare,  etc. ) care activează practic toate reacţiile posibile de un anumit tip.

Se disting multe tipuri şi grade de specificitate in acţiunea enzimelor.  In primul rând trebuie menţionată specificitatea stereochimică,  care constă in aceea că o enzimă care catalizează reacţia unui compus optic activ este fără acţiune asupra enantiomerului sau şi in general,  asupra izomerilor sterici ai acestui compus,  supuşi aceloraşi condiţii.  Fenomenul a fost observat întâi la Pasteur,  care l-a folosit ca o metodă pentru separarea izomerilor optici.  Vom mai aminti aici dehidrogenaza lactică din muşchi,  o enzimă care lucrează in colaborare cu DPN,  şi care dehidroginează acidul L-lactic la acid piruvic si hidrogenează acidul piruvic numai la acid L-lactic,  fiind inactivă faţă de acidul D-lactic.  In multe microorganisme există insă o enzimă care acţionează in mod similar dar specific numai asupra acidului D-lactic.  De asemenea,  peptidazele acţionează numai asupra aminoacizilor din seria L,  iar arginaza transformă prin hidroliză in ornitină şi uree, numai L-arginina şi este fără acţiune asupra D-argininei.

Din alt punct de vedere se  disting intre o aşa-numită specificitate de reacţie şi o specificitate de substrat a enzimelor.  Prima se referă la reactantul anorganic care ia parte la reacţie: apa in reacţiile de hidroliză,  acidul fosforic in reacţiile cu fosforoliza,  hidrogenul in reacţiile catalizate de dehidrogenaze.  Specificitatea de substrat priveşte natura reactantului organic,  ştiut fiind că enzimele care hidrolizează,  de exemplu,  hidraţii de carbon nu hidrolizează proteine,  cele care hidrolizează dipeptide nu hidrolizează polipeptide.

Specificitatea de substrat se manifestă in forme nenumărate şi stă la baza clasificării enzimelor,  după cum se va vedea mai departe.  Important este faptul că,  diferitele enzime prezintă faţă de substaturile respective grade diferite de specificitate.  Vom distinge 3 grade sau tipuri de specificitate enzimatică.  Pentru ilustrarea fenomenului vom considera o reacţie de hidroliză schematizată:

Sunt cazuri,  deşi rare,  când numai natura legăturii dintre A şi B determină specificitatea,  natura componentelor A şi B fiind indiferentă; se vorbeşte in aceste cazuri de o specificitate redusă.  Un exemplu este acela al lipazelor din pancreas şi ficat,  care hidrolizează esterii celor mai variaţi acizi carboxilici cu alcoolii de diferite tipuri,  printre care şi trioli cum este glicerina.  Nu toate esterazele sunt insă atât de puţin specifice.

Un al doilea tip de enzime posedă o specificitate limitată,  numită specificitate de grup.  In cazul unei reacţii de hidroliză,  cum este aceea considerată mai sus,  enzimele de acest tip cer ca A să fie de un anumit tip,  natura componentei B fiind indiferentă.  Un exemplu de enzimă inzestrată cu asemenea specificitate este acela al a-glicozidazei (maltazei) din sucul intestinal al mamiferelor şi al b-glicozidazei (emulsina).  Fiecare din aceste enzime hidrolizează atât dizaharide cât şi glicozide; ele sunt deci specifice numai pentru restul de monozaharidă şi intr-o mare măsură indiferente pentru natura agliconului.

Al treilea tip de specificitate,  numită specificitate absolută,  se caracterizează prin aceea că enzima este adaptată unui substrat unic,  „întocmai ca o cheie in broasca ei”.  In schema de mai sus,  ambele componente A şi B trebuie să fie de un anumit fel dat,  pentru ca enzima să acţioneze.  Acest tip de specificitate este mult răspândit; datorită aceste particularităţi există in natură un număr atât de mare de enzime.  Vom menţiona,  ca exemplu,  maltaza din bobul de orz incolţit,  care,  spre deosebire de a-glicozidazele menţionate,  hidrolizează numai maltoza,  dar este fără acţiune asupra altor dizaharide sau a-glicozide.  In mod similar,  tanaza hidrolizează numai esterii acizilor benzoici substituiţi cu cel puţin două grupe OH in alte poziţii decât orto faţă de carboxil,  iar clorofilaza nu hidrolizează decât cele două clorofile a şi b; fumaraza nu adiţionează apă decât la acidul fumaric spre a da naştere acidului (-)-malic.

Formarea unui complex intermediar intre substrat şi enzimă.  Se ştie că acţiunea unui catalizator constă in participarea sa efectivă la reacţia chimică.  Un catalizator se deosebeşte de un reactant obişnuit numai prin aceea că el se regenerează necontenit in cursul procesului chimic.  Enzimele nu diferă,  in această privinţă,  de catalizatorii simpli.  Specificitatea enzimelor sugerează participarea enzimei la reacţia chimică,  adică la formarea unui complex intre enzimă şi substrat.

Măsurătorile cinetice sprijină această concepţie.  In majoritatea cazurilor,  in condiţii comparabile,  viteza reacţiei enzimatice este proporţională cu concentraţia enzimei.  De obicei,  proporţionalitatea aceasta se observă numai in stadiul iniţial al reacţiei; pe măsură ce concentraţia produşilor de reacţie creşte,  viteza de reacţie scade datorită unui efect inhibant al acestor produşi.  De aceea se iau in consideraţie pentru comparaţie numai vitezele iniţiale ale reacţiilor enzimatice.

Pornind de la o cantitate fixă de enzimă şi mărind progresiv,  intr-o serie de experienţe succesive,  concentraţia substratului,  viteza de reacţie iniţială creşte din ce in ce mai incet cu concentraţia substratului,  până ce atinge o valoare constantă maximă,  dincolo de care viteza nu mai variază cu concentraţia.  La concentraţii mici de substrat,  reacţia este de ordinul I,  iar la concentraţii mari devine de ordinul zero faţă de substrat.

Aceste observaţii au dus la concepţia că intre enzimă (E) şi substrat (S),  se formează printr-o reacţie reversibilă ascultând de legea maselor,  un complex labil.  Acest complex reacţionează apoi irversibil,  cu viteză mare,  cu un reactant,  dând produsul de reacţie (P) şi regenerând catalizatorul:

Coenzime (cofactori).  In afară de enzimă şi substrat,  mai este necesară de multe ori prezenţa altor substanţe pentru ca reacţia enzimatică să se producă.  La fermentaţia alcoolică,  pe lângă prezenţa unei enzime termolabile,  nedializabile,  este necesară şi o coenzimă termostabilă şi dializabilă.  Mai târziu,  coenzimele fermentaţiei alcoolice (cocarboxilaza şi codehidraza I) au fost izolate şi de asemenea au fost izolate coenzimele altor procese enzimatire; structura acestor coenzime a fost apoi determinată.  In unele cazuri,  s-a putut stabili exact funcţiunea indeplinită de coenzimă in procesul enzimatic.

Coenzimele îşi îndeplinesc funcţiunea catalitică asupra substratului numai in prezenţa unei enzime.  Aceasta din urmă este specific adaptată substratului; o coenzimă poate cataliza uneori reacţiile unui număr mare de substraturi,  asociată insă de fiecare dată cu o altă enzimă.  Coenzimele sunt,  deci,  mai puţin specifice decât enzimele.

In timp ce enzima fixează şi uneori activează substratul,  coenzima participă la reacţie,  adică suferă o transformare chimică.  In stadiul următor al procesului,  coenzima modificată revine la starea iniţială,  fiind gata pentru o nouă reacţie.  Cum reacţiile respective sunt foarte rapide,  sunt sufiente concentraţii mici de coenzimă.

Pentru exemplificare vom aminti rolul jucat de codehidraza I in fermentaţia alcoolică.  In colaborare cu dehidrogenaza fosfatului de trioză,  codehidraza I catalizează transformarea fosfatului glicerinaldehidei in acid D-fosfogliceric,  trecând ea insăşi in hidrocodehidrază; aceasta din urmă reduce un anumit acceptor de hidrogen,  acetaldehida,  regenerând codehidraza I.  Legată de alte proteine,  hidrocodehidraza hidrogenează alţi acceptori de hidrogen.  Codehidrazele sunt,  deci,  coenzimele unor reacţii de transfer de hidrogen,  de la un donor la un acceptor de hidrogen.

Intâlnim un mecanism similar in reacţiile de transfer de acetil,  in care intervine coenzima A.  Aceasta reacţionează cu un donor de acetil,  in prezenţa unei enzime specifice,  trecând in acetil-coenzimă A,  cu grupa CH₃CO legată de S.  Acetil coenzima A difuzează apoi prin soluţie până intâlneşte o altă enzimă cu ajutorul căreia cedează grupa acetil unui acceptor.  Eliberată de grupa acetil,  coenzima A reia acest joc.  Acidul adenosin-trifosforic funcţionează in mod similar ca o coenzimă transmiţătoare de fosfat.

Sistemele enzimatice care conţin un metal in grupa prostetică sau sub altă formă,  indispensabil activităţile lor sunt numite metaloenzime.  Flavoproteinele conţin in afară de proteină şi FAD (flavin-adenin-dinucleotidă),  şi un metal,  ca fier (succino-dehidrogenază),  molibden (xantin-oxidază) sau altele.  Uneori ionii metalici joacă rolul de activatori,  de exemplu Mg²⁺ pentru multe enzime de fosforilare.  Mecanismul acţiunii specifice a acestor metale nu este cunoscut.

Coenzimele respiraţiei.  Este cunoscut rolul important al reacţiilor de oxidare cu oxigen molecular,  pentru producerea energiei necesare funcţiilor vitale ale organismelor.  Nu există nici o enzimă capabilă să transfere direct unei molecule de oxigen hidrogenul eliminat de substraturile curente din organismele vii.  Pentru a se combina cu oxigenul,  este necesară intervenţia unui sistem complex de enzime şi coenzime.  Enzimlele fac parte din clasa oxido-reductazelor (dehidrogenaze şi oxidaze).  Hidrogenul cedat de substrat este întâi acceptat ce DPN (codehidraza I),  asociate după caz cu o enzimă specific adaptată substratului.  Soarta coenzimelor hidrogenate care se formează depinde de condiţiile anaerobe sau aerobe in care are loc reacţia.  In condiţii anaerobe,  hidrocodehidraza cedează hidrogenul unui acceptor din mediul de reacţie.

Proprietatea aceasta a dehidrogenazelor de a transfera hidrogen din substrat la diferiţi acceptori a fost descoperită de Thunberg in 1917.  Tehnica folosită de acest cercetător pentru a decela transferul anaerob de hidrogen s-au mai corect pentru a pune in evidenţă prezenţa unui sistem enzimatic capabil de a transfera hidrogen,  constă in folosirea colorantului albastru-metilen ca acceptor.  Aceasta se decolorează trecând in leucoderivatul său.

Centre active ale enzimelor.  Se ştie că nu toate enzimele necesită colaborarea unei coenzime.  Coenzimele intervin mai ales in reacţiile de transfer: de hidrogen,  de electroni,  de grupe de fosfat,  de acetil,  etc.  Numeroase enzime,  printre care şi hidrolazele îşi exercită acţiunea lor enzimatică fără intervenţia unei coenzime.  Enzima este activă numai in forma ei nativă,  căci prin denaturare activitatea specifică a enzimelor dispare.  Activitatea enzimatică este insă restabilită atunci când enzima poate fi regenerată,  adică atunci când poate fi reconstituită structura terţiară sau cuaternară a proteinei distrusă prin denaturare.

            Se ştie insă că nu toată catena polipeptidică a enzimei participă la actul propriu-zis al catalizei,  ci numai o mică porţiune a ei,  numai anumite grupe,  dintr-o regiune bine delimitată a catenei polipeptidice,  aşa numitul centru activ al enzimei.  La această constatare s-a ajuns prin experienţe de inhibare a activităţii enzimei blocând centrul activ cu anumiţi reactivi cu care acesta se combină.  Inhibitorii de acest fel acţionează in proporţie stoechiometrică faţă de enzimă,  ceea ce este un indiciu că ei reacţionează cu anumite grupe ale catenei polipeptidice.